Як зважити молекулу: мас-спектрометрія в біохімії

Людина давно цікавиться тим, з яких речовин складаються відомі їй речі. Наука пропонує широкий арсенал інструментів для аналізу будь-яких об’єктів – від питної води до далеких зірок. Але найскладніше визначити з чого складається живі організми, оскільки кожна клітина містить десятки і сотні тисяч найрізноманітніших речовин. Сучасні хімія та фізика розробили багато методів аналізу біологічних молекул, один з найпотужніших – мас-спектрометрія.

Визначення молекулярної маси біоорганічних сполук є важливою складовою роботи сучасного біохіміка. Молекулярна маса – це сукупність мас всіх атомів які утворюють дану молекулу. В свою чергу, атомна маса – це сукупність мас усіх протонів, нейтронів та електронів даного атому. Її часто вимірюють у відносних одиницях – дальтонах (Dа). Якшо молекулярна маса сполуки відома з високою точністю, то цій масі може відповідати лише певна обмежена кількість комбінацій атомів. Наприклад, aмінокислота аланін має наступний хімічний склад: С3Н7NО2. Молекулярна маса аланіну відповідно складаєтся із двох мас вуглецю, семи мас водню, маси азоту і двох мас кисню. Високоточні маси елементів є табличними даними, отже молекулярна маса аланіну: (312 Da) + (71,0078250321 Da) + (14,0030740052 Da) + (2*15,9949146221 Da) = 89,04791186942 Da. Але і навпаки молекулярній масі 89,04791186942 Da відповідає (шляхом перебору) лише одна комбінація атомів: С3Н7NО2 – лише сума цих атомарних мас дає 89,04791186942 Da. Отже, можливість дуже точно визначити масу молекули дає цінну інформацію щодо ії ідентіфікації. Визначення молекулярних мас проводять за допомогою мас-спектрометрів. “Золотим стандартом” мас-спектромeтрії на сьогодні є мас-спектрометричний детектор Orbitrap.

В основі його дії лежить той факт, що eлектpичні поля міняють траекторію іонів, що переміщуються в полі (позитивно чи негативно заряджених). Позитивний іон, що рухаєтся паралельно позитивно зарядженій пластині, почне відхилятися від неї завдяки силі відштовхування між однаковими зарядами.

Orbitrap складається з двох концентричних електродів.

За рахунок специфічноії геометрії між електродами створюєтся неодноріне електростатичне поле. Іон, який має той же заряд що і електроди “влітаючи” з певною початковою швидкістю в це електростатичне поле “відштовхуєтся” від обох стінок-електродів і наче потрапляє в пастку.

Оскільки точковий заряд в електростатичному полі ніколи не досягає статичної рівноваги (тобто він повинен весь час рухатись) то “спійманий“ іон починає коливатися в Орбітрапі, описуючи складну траекторію, зображену на малюнку справа.

Частота коливань вздовж центрального електрода залежить лише від співвідношення маси іону до його заряду: ώz ~ m/z . В Orbitrap‘i можуть бути одночасно “зловлені” тисячі іонів різних мас – всі вони будуть мати свої специфічні частоти коливань. Реєстрація частот відбуваєтся завдяки появі струму в кільцевому електроді (що охоплює середню частину електрода зовнішнього). Математичне перетворення Фур‘є дозволяє з, на перший погляд, хаотичного спектру виділити специфічні частоти кожного іона та вирахувати з кожної специфічної частоти певне співвідношення маси до заряду:

За рахунок того, що частота коливання вимірюєтся з великою точністю (порівняно до інших можливих параметрів руху іонів), визначена молекулярна маса дуже близька до теоретичної (тобто справжньої маси іону).

Головною проблемою для точного визначення маси є потреба перетворити нейтральну молекулу на заряджений іон. В неорганічній і органічній хімії для іонізації використовуються “жорсткі” методи – наприклад, нагрівання до дуже високої температури або бомбардування пучком електронів. В біохімії це неможливо, оскільки біологічні речовини легко руйнуються, особливо якщо це великі білки або нуклеїнові кислоти. Цю проблему вирішила лабораторія Джона Фенна, за що її керівник був нагороджений Нобелівською премією з хімії у 2002 році. Розчин аналізованого зразка подається в мас-спектрометр через металевий капіляр під напругою в кілька тисяч вольт. Енергія електричного поля недостатня для розриву зв’язків між атомами (отже досліджувані молекули не руйнуются), але достатня для процессу, схожого на електролітичну дисоціацію. Біологічні сполуки, такі як амінокислоти або фосфоліпіди, що містять “кислі” функціональні групи (гідроксильні, карбонільні тощо), втрачають протон і перетворюються на негативо заряджені іони. “Лужні” речовини – наприклад аміни – навпаки утворюють аддукти с протонами або просторово невеликими позитивними іонами (аммоній, іони літію). Знов таки на прикладі аланіну:

Отримати загальне уявлення про те, як це все працює разом, можна з наступного відеоролика:

Як уже зазначалося, сучасні мас-спектрометри (один з яких ми описали) дозволяють дуже точно вимірювати молекулярні маси тисяч речовин за дуже короткий проміжок часу. Сьогодні біохімія стоїть перед наступним завданням – як коректно аналізувати отримані дані і робити біологічно важливі висновки?