Молекулярна біологія ВІЛ


Зв’язування і вхід в клітину

Структура вірусу імунодефіциту являє собою ліпідну мембрану, яка створює зовнішню оболонку, інтегровані в неї протеїни клітини хазяїна та глікопротеїди (GP) 120 і 41 (рис. 1). Всередині самого вірусу є капсид, що оточує дві вірусні РНК, і регуляторні білки (Tat, зворотна транскриптаза та інтеграза).

925-1
Рисунок 1. Структура вірусу імунодефіциту людини
Автор: Thomas Splettstoesser (www.scistyle.com)

Комплекс GP120 та GP41 на зовнішній поверхні вірусу є комплементарним до рецепторів специфічних CD4+ лімфоцитів [1]. Сама РНК має довжину 9 кілобаз та складається з 9 генів, що кодують 15 протеїнів (рис. 2).

925-2
Рисунок 2. Будова вірусної РНК
Автори: Warner C. Greene, MD, PhD, University of California San Francisco
B. Matija Peterlin, MD, University of California San Francisco

Глікопротеїди зв’язуються с CD4 рецептором і С-С хемокіновим рецептором п’ятого типу (CCR5 (В нормі ці рецептори клітини беруть учать у хемоаттракції, в якій гематопоетичні клітини рухаються вздовж хемокінових градацій)) [2] в процесі входження у клітину. Зв’язування поверхонь gp120, CD4 та хемокінових корецепторів, продукують радикальні зміни конформації в gp41. Зібрані тримером на мембрані віріона, ці суперспіралізовані протеїнові пружини відкриваються, випускаючи домен злиття, який «гарпунує» біліпідний шар клітини-мішені (рис. 3) [3].

925-3
Рисунок 3. Входження вірусу у клітину.
1. Початкова взаємодія між gp120 і CD4.
2. Конформаційні зміни в gp120 дозволяють вторинно взаємодіяти з CCR5.
3. Дистальні кінці gp41 входять до клітинної мембрани.
4. gp41 піддається значним конформаційним змінам: складається навпіл і формуєся спіральна-котушка. Цей процес притягує вірусну і клітинну мембрану, змішуючи їх.
Автор: Mike Jones (https://en.wikipedia.org/wiki/User:Adenosine?rdfrom=commons:User:Adenosine)

Події в цитоплазмі

Опиняючись в клітині вірус звільняється від своєї ліпідної оболонки (рис. 4). Після цього в цитоплазмі клітини опиняється вірусний зворотньо-транскрипційний комплекс і група білків регуляторів. Білок Nef зв’язується з універсальною протонною помпою (V-ATPase) [4] і формує сприятливий рН для вірусу в цитоплазмі. Зворотно-транскрипційний комплекс складається з диплоїдної вірусної РНК, лізин-трансфер РНК (tRNALys), який діє як праймер для зворотної транскрипції, зворотної транскриптази, інтегрази, матричних і нуклеокапсидних протеїнів, вірусного протеїну R (Vpr), та різних білків клітини хазяїна. Комплекс зв’язується з актиновими мікрофіламентами, ця взаємодія, регульована фосфорильованим матриксом, потрібна для ефективного синтезу вірусного ДНК.

925-4
Рисунок 4. Схематичне зображення циклу вірусу у клітині від моменту входження до моменту відбруньковування нового вірусу
Автор: Thomas Splettstoesser (www.scistyle.com)

Входження в ядро

На відміну від тваринних ретровірусів, ВІЛ інфікує клітини які не діляться (диференційовані макрофаги) [5]. Ця особливість вимагає від вірусу механізмів проникнення через неушкоджену ядерну оболонку. Приблизний діаметр пор у оболонці 28 нм в той час як розміри вірусу втричі більше. Вірусна ДНК, яка була синтезована в попередній фазі повинна скластись втроє щоб пройти крізь мембрану [6].

В імпорті залучаються білок інтеграза, матричний протеїн (матрикс), Vpr. Матрикс включає в себе канонічний ядерний сигнал локалізації, що є тригером для активації білків-імпортинів альфа і бета, які є компонентами класичного ядерного транспорту [7]. В той самий час Vpr має в собі як мінімум три неканонічні ядерні сигнали. Він проходить через імпортну систему і спричиняє зв’язування преінтеграційного комплексу з білковими комплексами ядерних пор, таким чином, імпортуючи вірус в ядро.

Інтеграція в ДНК клітини

Опиняючись у ядрі, преінтеграційний комплекс може почати облаштовувати функціонуючий провірус. Процес вбудовування вірусної ДНК регулює білок інтеграза. Вона забирає кінцеві нуклеотиди з вірусної ДНК, роблячи двостороннє вкорочення, і коректуючи нерівні кінці, які були утворені роботою зворотної транскриптази.

Не всі преінтеграційні комплекси, які попадають в ядро починають облаштовати функціонуючий вірус. Кінці вірусного ДНК можуть з’єднуватись формуючи 2-LTR коло, паралельно з цим існує можливість, що вірусний геном пройде гомологічну рекомбінацію, утворюючи одне LTR коло. Нарешті, вірусна ДНК може інтегруватись сама в себе, формуючи перебудовану кільцеву структуру.

Серед різноманіття описаних колових структур, деякі з них відповідальні за синтез транскрипційного трансактиватора Tat або додаткового білка Nef [8]. При нормальній клітинній відповіді на ворожу ДНК і її фрагменти, активується система негомологічного з’єднання кінців, яка може формувати 2-LTR кола для захисту клітини від апоптозу під час виправлення порушень в ДНК клітини. Одне порушення в будь-якй ділянці подвійної спіралі може індукувати арешт клітини в G1 фазі її мітозу. Здатність вірусу мімікрувати дію цієї системи дає можливість вберегти інфіковану клітину від апоптозу, дозволяючи йому далі існувати в клітині.

Транскрипційний контроль

Вірусний 5´ LTR функціонує так само, як і інші еукаріотичні транскриптори. Він включає в себе ініціатор (Inr), TATA-box (T) та три Sp1 ділянки [9]. Ці ділянки допомагають розмістити РНК полімеразу ІІ (RNAPII) на стороні ініціації транскрипції та беруть участь в формуванні преініціаційного комплексу. Трохи вище за промотор знаходиться транскрипційний посилювач, який зв’язує ядерний фактор [kappa]B (NF-[kappa]B), ядерний фактор активованих Т-клітин (NFAT) та членів сімейства Ets. NF-[kappa]B та NFAT переміщуються в ядро після їх клітинної активації. NF-[kappa]B звільняється від свого цитоплазматичного інгібітору (I[kappa]B) за допомогою комбінованої дії фосфориляції, убіквінації та протеасомної деградації інгібітору [10]. Опиняючись в ядрі він відповідальний за збільшення частоти ініціації та елонгації вірусної транскрипції [11]. NFAT в свою чергу дефосфорилюється кальцінейріном і після свого потрапляння в ядро зв’язується з АР1, формуючи готовий претраскрипційний комплекс (рис. 5-б) [12].

Коли всі ці фактори діють на LTR активується транскрипція, але за відсутності Tat полімераза не зможе подовжувати вірусний геном (рис. 5-а).

925-5
Рисунок 5. (Ліва частина – а, права – б)
а – відсутність ефективності в елонгації геному вірусу без Tat
б – претранскрипційний комплекс вірусу
Автори: Warner C. Greene, MD, PhD, University of California San Francisco
B. Matija Peterlin, MD, University of California San Francisco

Tat разом з цикліном T1 (CycT1) зв’язується з TAR РНК і залучає при цьому циклін залежну кіназу 9 (CDK9) до вірусного LTR [13].

CDK9 разом з P-TEFb (позитивний транскрипційно-елонгаційний фактор b) фосфорилює С-термінальний домен RNAPII, помічаючи перехід з ініціації до елонгації еукаріотичної транскрипції. Іншими мішенями P-TEFb є N-TEF (негативні транскрипційно-елонгаційні фактори) такі як DSIF та NELF[14]. Висока ефективність вірусного LTR в притягувані до себе цих негативних факторів транскрипції in vivo пояснює чому LTR за відсутності Tat є поганим промотором.

Вірусна транскрипція

Транскрипція вірусного геному являє собою сумацію роботи більше дюжини ВІЛ-специфічних транскриптів [15]. Ці багаторазово порізані ділянки геному вірусу кодують Nef, Tat та Rev, ензимні та додаткові протеїни що потрібні для збирання нового вірусу і являють собою вірусні геномні РНК.

Транспорт цих ділянок до цитоплазми напряму залежить від кількості Rev. Rev це маленький курсуючий протеїн, який зв’язує комплекс РНК під назвою RRE (Ren відповідний елемент), що знаходиться в гені env.

Ядерний транспорт комплексу вірусного РНК-траскрипту, Rev та CRM1/exportin 1, залежить від ще одного фактору-RanGTP. Ran – це гуаніновий нуклеотидно-зв’язуючий протеїн, який переключається між GTP- та GTP-обмеженим станами.

Для поширення вірусу потрібно досягти балансу між транспортом та розрізанням вірусної РНК. Якщо переважатиме розрізання (сплайсинг), то в цитоплазмі буде з’являтись лише фрагментовані транскрипти. Але й повність виключити наявність порізаних транскриптів неможливо, тому що вони кодують специфічні білки, які потрібні для забезпечення повного вірусної реплікації. Наприклад, при недостатньому розрізуванні і ,як наслідок недостатньої продукції вірусних транкскриптів відбудеться порушення синтезу Tat, Rev, та Nef.

Реплікація ВІЛ

На відміну від Tat та Rev, які діють безпосередньо на вірусні РНК структури, Nef діє на внутрішнє середовище інфікованої клітини, роблячи його сприятливим для вірусної транскрипції. Під час клінічних досліджень на мавпах, нестача в їх клітинах цього білка призводила до значного сповільнення прогресування вірусу. Механізм вірулентності ,який забезпечує Nef ,працює за принципом активації сигнальних каскадів, включаючи активацію антигенного рецептору Т-клітин та зменшення експресії CD4 рецепторів на поверхні клітини [16]. Діючи на сигнальний каскад, Nef опосередковано викликає зміни в актиновій сітці, провокуючи рух ліпідного «човника» і формування більших за розміром структур на поверхні мембрани клітини [17].

Також, Nef інгібує апоптоз клітини : він зв’язується та інгібує регуляційну кіназу-1 апоптотичного сигналу [18]. Також, він зв’язує білок р53 (білок супресор пухлин), який теж є ініціатором апоптозу.

Інші вірусні протеїни також беруть учать в модифікації внутрішньоклітинного середовища. Rev-залежна експресія Vpr включає в себе арешт клітини в G2 фазі мітозу. Саме в наслідок того, що LTR найбільш активна в саме цій стадії клітинного циклу, це призводить до підвищеної експресії вірусних генів.

Збирання нового вірусу і його відбруньковування

Нові копії вірусу збираються на плазматичній мембрані. Кожний віріон складається з 1500 молекул Gag та 100 Gag-Pol поліпротеїнів [19], двох копій вірусного РНК геному, та Vpr (рис. 6).

925-6
Рисунок 6. Новий віріон та його відбруньковування.
Автори: Ashley C. Humphries та Michael Way,
Nature Reviews Microbiology 11, 551–560 (2013) doi:10.1038/nrmicro3072

Кілька протеїнів беруть участь у процесі збирання включаючи Gag та Gag-Pol поліпротеїни, а також Nef та Env [20]. Людський АТФ-зв’язуючий протеїн (НР68) діє як молекулярний шаперон, сприяючи конформаційним змінам Gag, що необхідно для утворення вірусних капсидів [21]. Також важливу роль відіграє Vif. За його нестачі кількість реплікованих віріонів та сама, але вони не вірулентні, цей пояснюється арештом циклу вірусу на стадії роботи зворотної транскриптази.

Відбруньковування вірусу потребує наявності спеціальних ділянок в ліпідному бішарі (холестерол- та гліколіпідно-багаті мембранні мікродомени) для того щоб віріон вийшов з клітини з холестерол-збагаченою мембраною.

Сама реакція виходу потребує дії кількох протеїнів, включаючи послідовність «в кінці домену» (PTAP) [22], яка присутня в p6 частині Gag [23]. Продукт гену пухлинного супресора 101 (TSG101) зв’язує PTAP мотив p6 Gag і також розпізнає убіквітин через убіквітин ензим 2 (UEV) домен. В нормі цей ген взаємодіє з іншими клітинними протеїнами, сортуючи шляхи для формування комплексу ESCRT-1, який вибирає «вантаж» для включення його в мультивезикулярне тіло (MVB) [24]. MVB утворюється тоді, коли поверхні лізосом та ендосом спаюються та їх вміст перемішується для деградації. У випадку ВІЛ він «хакає» TSG101, щоб змусити його брати участь у відбруньковуванні нових віріонів за схожим механізмом.

Обговорення

Залишити відповідь

Ваша e-mail адреса не оприлюднюватиметься. Обов’язкові поля позначені *